Principio del espectrofotómetro – la Ley de Lambert-Beer

¿En qué consiste la ley de Lambert-Beer?

En el instante en el que un rayo de luz atraviesa un cuerpo (no importando lo pequeño que éste sea), se produce una pérdida notable en lo que se refiere a su intensidad, dado que como ya explicamos con anterioridad, el objeto que se interpuso en el camino de la longitud de onda, absorbió una porción de su materia.

Por otra parte, con el propósito de evitar errores en mediciones energéticas que se llevan a cabo con implementos como el espectrofotómetro, lo primero que se debe hacer es colocar un parámetro de control o referencia, el cual nos servirá para evaluar si los resultados obtenidos, concuerdan con lo esperado o no.

No podemos dejar de mencionar que el patrón con el que vamos a hacer las comparaciones pertinentes, contiene todos los compuestos presentes en la medición, exceptuando solamente a la sustancia que se está analizando.

La ley de Beer, nos menciona básicamente lo siguiente: La cantidad de absorbancia de un cuerpo o sustancia, es directamente proporcional tanto a la longitud de onda del paso de la luz como a la concentración de la misma.

Para calcular este criterio, es necesario utilizar la siguiente fórmula:

A = εdc

Dónde:

A es igual a la absorbancia. Al tratarse precisamente de la magnitud que se va a calcular, este apartado carece de algún valor numérico específico.

ε equivale al factor de absorción (a este a veces se le llama coeficiente molar de extinción). Por lo general, funge como una constante.

d corresponde a la distancia recorrida de un haz de luz. Este valor se expresa en centímetros.

c representa el grado de concentración que tiene el absorbente.

La ley de Beer-Lambert

Definición Absorbancia:
el registro negativo de la transmitancia.
A = – log 10 T

Este valor es más útil en espectrofotometría que en transmitancia, debido a que la gráfica de absorbancia vs concentración produce una línea recta. Una gráfica de transmitancia vs concentración es exponencial. El – log calcula el inverso de la transmitancia, de modo que la absorbancia aumenta al aumentar la concentración. La transmisión disminuiría a medida que aumentamos la concentración. Dos bioquímicos demostraron que la relación de Absorbancia con concentración sigue la ecuación para una línea recta, y = mx + b, donde m es la pendiente de la línea y b es la intersección en y. Si la medición se realiza de tal manera que b = 0 (es decir, una solución que no contiene colorante no tiene absorbancia), y si sustituimos Absorbancia por y, concentración por x y variante por m,

A = ε  C donde A = absorbancia C = concentración ε = el coeficiente de extinción

 

Tenga en cuenta que la variante es igual a la pendiente de la línea recta, que resultará de un gráfico de absorbancia (eje y) frente a concentración (eje x).

Para usar un espectrofotómetro es necesario establecer una serie conocida de diluciones que contengan cantidades conocidas de un soluto. Uno de estos no contendrá soluto y se conoce como el blanco. Se utiliza para ajustar el instrumento para leer 100% de transmitancia o 0 de absorbancia. En uso, se establece un valor de transmitancia del 0% (absorbancia infinita) colocando una cortina entre la fuente de luz y la fotocélula. El control electrónico se ejerce para que el medidor lea 0% de transmitancia en su escala. Se inserta la muestra en blanco (que no contiene soluto ni tinte), se abre la cortina y el medidor se reajusta para leer el 100% de transmitancia. Todas las demás medidas se realizan simplemente insertando las muestras en la trayectoria de la luz y midiendo el% de transmitancia.

Después de registrar la absorbancia para una serie de estándares, se realiza un gráfico del valor de absorbancia (eje y) frente a la concentración (eje x). La pendiente de la línea es el coeficiente de extinción.

Tenga en cuenta que esto puede calcularse directamente mediante la reordenación de la ley de Beer-Lambert a
ε = A / C.

Cualquier valor medido de A puede convertirse fácilmente a una concentración correspondiente simplemente dividiendo la absorbancia por el símbolo épsilon.

El uso de la ley de Beer-Lambert es fácil de visualizar con colorante rojo. Es igual de preciso medir longitudes de onda de luz que no son visibles. Se puede usar infrarrojo o ultravioleta. La radiación UV es más útil para los biólogos ya que muchas moléculas (todas las proteínas y ácidos nucleicos) absorben la luz ultravioleta. El único cambio que debe hacerse es el uso de cubetas de cuarzo en lugar de tubos de vidrio. El vidrio absorbe la luz UV y, por lo tanto, no es adecuado para su uso en un espectrofotómetro UV. Un instrumento capaz de usar luz visible (generalmente con una fuente de lámpara de tungsteno o halógeno) y luz UV se conoce como espectrofotómetro UV / Vis.

En los análisis químicos, los siguientes tres métodos pueden utilizar la Ley de Beer:

1. Cálculos absolutos: la capacidad de absorción o la capacidad de absorción molar se calcula midiendo la absorbancia de un estándar de concentración conocida en un ancho de celda conocido. Este valor calculado se usa para determinar una concentración desconocida de la misma especie absorbente a partir de la medición de absorbancia a esa concentración.

2. Análisis de curvas de trabajo:La absorbancia de una serie de tres a cinco soluciones estándar se mide y se traza en papel cuadriculado contra las concentraciones de estos estándares. Esto se conoce como una trama de la Ley de Beer. Luego se mide la absorbancia de una concentración desconocida, y su concentración se determina directamente del gráfico. Este método se usa más comúnmente que el cálculo absoluto, porque el error experimental se promediará sobre el número de estándares.

beer

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